1基本說明

EHA105菌株由EHA101菌株改造而來，為C58型背景，核基因中含有篩選標簽——利福平抗性基因rif，為了便于轉化操作，此菌株攜帶一無自身轉運功能的琥珀堿型Ti質粒pEHA105 (pTiBo542DT-DNA)，此質粒含有vir基因(vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pEHA105 (pTiBo542DT-DNA)質粒自身的T-DNA轉移功能被破壞，但可以幫助轉入的雙元載體T-DNA順利轉移)。在EHA105菌株中轉入help質粒：pSoup即為EHA105 (pSoup)菌株，可幫助pGreen，62SK，pGs2系列質粒在農桿菌中復制，同時賦予該菌株四環(huán)素（tet）抗性，適用于水稻、煙草等植物的轉基因操作。本公司生產的EHA105(pSoup)化學轉化感受態(tài)細胞經特殊工藝制作，pGs2(卡那霉素抗性)質粒檢測轉化效率>104 cfu/μg DNA。

2基因型

C58 (rifR) Ti pEHA105 (pTiBo542DT-DNA) Succinamopine (pSoup-tetR)

3儲存及使用環(huán)境

1.本產品應保存在-80℃，不可反復凍融或放置時間過長，否則會降低轉化效率。

2.進行轉化過程中，請根據(jù)相應溫度及無菌條件的要求進行。

4操作方法

1.取-80℃保存的農桿菌感受態(tài)于室溫或手心片刻待其部分融化，處于冰水混合狀態(tài)時插入冰中。

2.每100μl感受態(tài)加入0.01-1μg質粒DNA（轉化效率較高，第一次使用前最好做預實驗確定所加質粒的量），用手撥打管底混勻，依次于冰上靜置5分鐘、液氮5分鐘、37℃水浴5分鐘、冰浴5分鐘。

3.加入700μl無抗生素的LB或YEB液體培養(yǎng)基，于28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時。

4. 6000 rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天

（當平板只含有50μg/ml kan時，28℃培養(yǎng)48 h即可；平板中同時加入50μg/ml kan，20μg/ml rif時，需28℃培養(yǎng)60 h；如果使用的平板含有50μg/ml rif則需要28℃培養(yǎng)72-90 h）。 

5注意事項

1.加入質粒時體積不應大于感受態(tài)體積的1/10；質粒不純或存在乙醇等有機物污染，轉化效率急劇下降；質粒增大一倍，轉化效率下降一個數(shù)量級。

2.轉化高濃度的質粒可相應減少最終用于涂板的菌量，本公司生產的EHA105(pSoup)化學轉化感受態(tài)細胞具有四環(huán)素抗性，但在轉入目標質粒涂板篩選陽性克隆時，只需加入目標質?？剐缘目股?，不加四環(huán)素。
3.平板上陽性克隆密度過大時，由于營養(yǎng)不足，陽性克隆生長變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應減少質粒用量。

4.利福平濃度不應高于25μg/ml，過高的利福平濃度不利于農桿菌生長，會降低其生長速度和轉化效率。

5.培養(yǎng)基中加入利福平的目的是防止雜菌生長、篩選農桿菌；根據(jù)所用菌株抗性加入鏈霉素或慶大霉素可防止Ti質粒丟失，但鏈霉素不利于農桿菌的轉基因操作，培養(yǎng)農桿菌時不考慮鏈霉素或慶大霉素，Ti質粒丟失的概率極低(可以忽略)。